外泌体的定位观察
近年来，体内肿瘤细胞、免疫细胞等各类细胞分泌的细胞外囊泡（EV：extracellular vesicles）开始受到关注。细胞外囊泡存在于绝大多数的体液（血液、尿、髓液等）及细胞培养液中，是一种细胞分泌的小型（直径约30 nm至100 nm）囊泡。
根据不同的生成机制，细胞外囊泡可进一步细分为“外泌体（exosomes）”、“微泡（MV：microvesicles）”和“凋亡小体（apoptotic bodies）”。在过去的很长一段时间里，外泌体都被视为一种释放无用细胞内容物的囊泡。但是近年来，人们发现外泌体其实与恶性疾病、免疫疾病、神经疾病、传染病等各类疾病有着密切的关联，或许能够帮助人们查明病状，为治疗带来更多的可能性，这也使外泌体成为了备受关注的焦点。
下面黄金城将基于外泌体的生成机制、功能作用，以及相关的疾病治疗案例，从基础知识出发，介绍相关的观察事例。如果您对外泌体感兴趣，或是正在为观察分析方法𝔉感到困扰，希望下面的内容能够为您提供参考。
什么是外泌体
外泌体是细胞外囊泡的一种。细胞可利用一种名为“内吞作用（endocytosis）”的机制，将细胞外的物质转运到细胞内，生成名为“内体（endosome）”的囊泡。生成的囊泡将依次经历网格蛋白囊泡⇒初级内体⇒次级内体阶段。随后，含有大量腔内囊泡（ILV：intraluminal membrane vesicle）的多泡体（MVB：multivesicular body）会与细胞膜发生融合，将囊泡由内体释放到细胞外。这些被释放出来的囊泡，就是外泌体。
外泌体中含有各类蛋白质及核糖核酸（RNA：ribonucleic acid），这些成分源自各类分泌细胞，例如内体及细胞膜中的蛋白质、与细胞内运输相关的蛋白质等等。外泌体中还含有内体膜中的脂质和分泌细胞的细胞膜成分，这些内容物被称为“运输物（cargo）”。这种外泌体会被其他细胞吞食，外泌体内携带的蛋白质及RNA也会被传递到吞食外泌体的细胞中。
൩由此可见，外泌体在细胞间信息传递中发挥着重要的作用，尤其是在医疗领域，围绕外泌体的研究正在不断推进当中。
外泌体的摄取和作用
细胞摄取外泌体的机制目前尚不明晰，但报告显示受体细胞需要识别外泌体表面的分子。
外泌体的囊膜由脂质筏、膜转运蛋白和CD9/CD63/CD81等跨膜蛋白组成，但脂质的组成会根据其来源细胞而变化。而且，受体细胞是否具有能够识别外泌体表面分子的分子取决于受体细胞自身。
因此，在外泌体的药代动力学中，其囊膜与受体细胞分子的组合十分重要。
细胞摄取的外泌体经由核酸将信息递送给受体细胞。受体细胞基于核酸信息合成蛋白质。结果表明，免疫系统细胞分泌的外泌体抑制了某个特定基因的表达，并且促进了免疫反应。
例如，树突状细胞（一种抗原呈递细胞）分𒁏泌的外泌体含有MHC分子，因此通过将它们注入远离树突状🧔细胞的T细胞中，可以激活T细胞。
基于外泌体的疾病治疗
随着外泌体功能的日益明了，在以癌症早期发现、阿尔兹海默病、帕金森氏病、脊髓小脑变性症、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化（ALS）等神经变性疾病治疗为代🌳表的医学领域，将外泌体用于内分泌、循环系统的治疗法及诊断法研究正在如火如荼地开展当中。
癌症的早期发现
研究人员认为，外泌体可能与癌细胞的生存及恶化、转移等存在关联。在癌症患者体内癌细胞释放的外泌体中，含有源于癌细胞的各类蛋白质，会激活癌细胞特有的细胞杀伤性T细胞。这是因为源于癌细胞的外泌体含有癌症基因。这也就意味着，通过观察癌症患者体内细胞释放的外泌体，就能实现癌症的早期检测。
作为一种着眼于外泌体细胞间信息传递性质的癌症诊断法，液体活检（liquid biopsy）是发现早期癌症的重要手段。在基于液体活检的癌症诊断中♛，外泌体内容物能够反映释放源细胞的特征，例如癌症相关基因发生变🎀异的ctDNA（circulating tumor DNA），因此通过调查异常细胞的外泌体，或许能够实现癌症的早期发现。
阿尔兹海默病的治疗
阿尔兹海默病是一种因β-淀粉样蛋白毒性损伤致使神经细胞死亡，引起脑部萎缩后发生的痴呆症。在阿尔兹海默病的治疗中，外泌体会对作为病因物质的β-淀粉样蛋白及Tau蛋白*4的增减造成较大的影响。
除此以外，为了更加安全地将医药品高效输送（delivery）至特定的患病组织及细🅰胞，研究者们正在尝试在“药物传递系统（DDS：drug delivery system）”中，将药剂、核酸🐎等封入外泌体，实现精准给药。
- *4：Tau蛋白（tau protein）
- Tau蛋白是一种存在于中枢及末梢神经系统神经细胞中的蛋白质。它会与多种蛋白质结合，参与发生在脑神经系统中的各类现象，例如脑部的后天发育、成体的神经发生等等。这种Tau蛋白的异常，或许就是阿尔兹海默病等神经变性疾病的发病原因。
用于再生医疗
基于外泌体的再生医疗是指将干细胞等人工构建的组织移植到患者体内，从而再生和恢复受损脏器及组织的医疗方法。
间充质干细胞（Mensenchymal Stem Cell：MSC）分泌的外泌体（MSC外泌体）对癌症、肾脏疾病、心肌疾病、脑部疾病、肺部疾病等多种疾病具有治疗效果。此外，MSC还可以分化为内胚层及外胚层细胞，未分化的MSC分泌的分子对特定疾病以外的许多疾病具有治疗效果。
MSC具有“归巢”的能力，能够自发寻找损伤的部位并集中于所找到的部位，这种能力可以用于对过去无法给药的脏器和组织进行静脉给药。然后，积聚在损伤部位的MSC会分泌MSC外泌体用于再生和恢复组织。
由此，基于MSC外泌体的再生医疗展现出与基于iPS细胞的再生医疗不同的细胞疗♒法，在细胞治疗领域，ꦕ尤其是作为新型病毒感染的疗法备受关注。
液体活检诊断
液体活检（liquid biopsy）就是利用对身体负担较小的体液（体液、血液、尿液等样本）进行活检的技术，主要在癌症诊断领域发挥作用。
液体活检的样本中含有源自肿瘤及各类组织、细胞的信息，观察这些样本，可以全面掌握全身的肿瘤状况。
利用内窥镜及穿刺针采集样本的活检技术，不仅会给病人带来痛苦与风险，还只能采集极少部分的肿瘤组织，只能检测到零碎的癌症信息。
液体活检光用体液就能完成检测，可以在不对人体造成负担的前提下，开展癌症基因诊断及治疗效果预测。
什么是药物传递系统（DDS：drug delivery system）
药物传递系统是一种利用外泌体细胞间物质转运特性的治疗方法，可以将物质（蛋白质、核酸、脂质）运输到特定的细胞中。
这种疗法面世至今，已经成功验证了其对乳腺癌细胞的抗癌作用，并且曾通过将药物导入神经母细胞瘤细胞，成功减少了阿尔兹海默病诱发物质——β-淀粉样蛋白的量。
作为一种采用生物分子的疗法，外泌体DDS疗法与传统的纳米微粒药物运输疗法相比，毒性更低。人们在研究中还发现，外泌体DDS能够到♔达传统疗法难以穿透的组织深处，因此外泌体作为一种强有效的运输分子，正在受到越来越多的关注。
外泌体研究的展望
正如上文所说，随着医学及观察技术的发展，“传递细胞信息＝疾病转移”这一外泌体的负面特性摇身一变，成为了在疾病预防、早期治疗、细胞直接靶向投药等领域开辟先进疗法的王牌，并因此备受关注。
其实，蔬菜瓜果等植物的细胞同样会分泌外泌体。以生姜为例，生姜具有抑制酒精性肝损伤的效果，这或许是因为生姜释放的外泌体具有一定的护肝作用，可避免肝脏受损。还有研究报告指出，煮鸡蛋的外泌体具有抑制动脉硬化，增强记忆力的效果。
☂东方医学认为膳食乃医疗之根本，治疗疾ꦯ病的药物与促进健康的食物，原本就是同根同源的存在。从这一观点来看，围绕外泌体的研究给医疗和食品带来了更多的可能性，堪称是现代版的“药食同源”。
外泌体的检测
外泌体的ꦕ分析方法大致可分为2种。一种是从体液及细胞培养液中提取外泌🧜体，对由外泌体运输的蛋白质、脂质及RNA进行分析的方法。另一种则是直接在体液中检测分析外泌体的方法。外泌体被细胞吞食及分泌的具体过程，需借助荧光显微成像系统进行观察及分析。
使用体液及细胞培养液的分析方法
通常情况下，会采用超离心、超过滤等方法从血液、腹水等体液样本中分离提纯外泌体。但是，用此类方法提取到的外泌体，会混入性状、浓度相近的其他粒子、高质量蛋白质等杂质，很难单独分析外泌体。
为了解决这一问题，有时也会配合使用亲和纯化*1技术。为了确认最终分离提纯所得的样本是否为外泌体，还会借助动态光散射法或显微镜进行尺寸核实或者通过蛋白质印迹法进行验证*2。
- *1：亲和纯化（affinity purification）
- 利用能够与目标分子进行特异性可逆结合的分子（配体）反应，对目标分子、蛋白质或相应复合体实施分离提纯的方法。
- *2：蛋白质印迹法（western blotting：WB）
- 一种用于了解蛋白质特性的基础实验方法，可用于测量在外泌体中表达的蛋白质。
直接从体内进行检测的方法
人们正在研究无需分离提纯外泌体，直接在体液中进行检测的方法，例如，常被用于癌症治疗领域的，“流式细胞光度术*3”、“微阵列分析”、“表面等离子共振”等等。除此以外，还有以大肠癌诊断为目的的ExoScreen法。
不同于利用内窥镜及穿刺针采集肿瘤组织的传统活检（biopsy），以血液等体液为样本，实施诊断及治疗效果预测的“液🐭体活检（liquid bio𝓰psy）”，已经成为了一种备受期待的新兴肿瘤早期发现技术。
- *3：流式细胞光度术（flow cytometry）
- 利用以激光照射细胞及微粒时产生的散射光或荧光，对粒子特性进行评估的技术。能够同时对单种细胞（细胞、细菌等）的多项特征进行高速测量。适用于评估外泌体的蛋白质表达量及其进入细胞内部的情况。虽然难以进行定量分析及囊泡种类的区分，却是一种能够观察细胞内吞外泌体过程的极简便方法。
外泌体的观察和分析
外泌体的直径约为30 nm至150 nm，很难用光学显微镜观察。使用电子显微镜则要面临繁琐的制样操作、真空和电子束导致变质的问题，物性测量也并不常见。最关键的是，电子显微镜并非适用于所有设施。
而利用荧光显微成像系统观察外泌体，则能借助荧光标记实现外泌体的可视化，进行跟踪观察。可以用荧光色素对提取到的外泌体中所含的RNA（RNA运输物）或外泌体膜进行染色，实现可视化观察。
借助上述方法，可以对外泌体的经时分布变化，外泌体的细胞间信息传递过程（即细胞内吞外泌体的情况）进行监控。荧光显微成像系🌞统能够进行其他方法难以实现的观察，例如观察外泌体变化及相应过程等，作为一项可实现更高精度分析的新技术而备受🌞关注。
通过荧光显微镜确认外泌体的三维定位
使用荧光显微镜很难对焦，给观察定位带来了不小的困难。而使用流式细胞分析仪（利用以激光照射细胞及微粒时产生的散射光或荧光，对粒子特性进行评估的仪器）进行分析，则无法确认定位及经时变化。
一体化荧光显微成像系统BZ-X800使用基于“电气投影元件”的结构化照明（Structured Illumination），运用出色的光学切片技术，呈现超越过往的清晰图像。定位及经时变化都能清晰呈现。
在下列示例中，研究者利用BZ-X800的切片功能，对人类表皮细胞中外泌体进行了定位观察。
BZ-X800能够借助高精细图像，观察某个细胞释放的外泌体，移动进入其他细胞内部的过程。
外泌体：绿色（PKH67）、细胞膜：红色（CellMaskTM Orange）、细胞核：蓝色（DAPI）
如果引进一体化荧光显微成像系统BZ-X800
- 全电动控制，操作简单便捷。能够轻松移动到目标观察位置，实现高效观察。
- 借助可进行光学切片拍摄的切片功能，不会拍摄出非焦平面的荧光模糊图像，对微弱信号也能清晰捕捉。
- 可根据Z方向的移动间距信息构建高精细的渲染后的3D图像。可对细胞定位进行三维观察。
- 可利用延时拍摄，轻松拍摄到目标物的经时变化。
